4D组学新时代!更精确的磷酸化修饰组学

2019年8月05日 16:55:58 来源: 布鲁克(北京)科技有限中马堂30码期期中-质谱仪器
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离子淌度分离概念的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。4D蛋白质组学是在3D分离即保留时间(retention time)、质荷比(m/z)、离子强度(intensity)这三个维度的基础之上增加了第四个维度,离子淌度(mobility)的分离(图1),进而大幅度的提高扫描速度和检测灵敏度,带来蛋白质组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。

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更精确的磷酸化修饰组学


磷酸化是30码期期中最广泛的翻译后修饰类型,在多种生命活动的调控包括生物的生长发育、信号转导以及疾病进程等过程中发挥至关重要的功能。当下蛋白质组学30码期期中正如火如荼地发展,随着技术的不断成熟,依赖于质谱的蛋白质磷酸化的检测,极大地推动了磷酸化蛋白质组学的发展。

然而对于传统的质谱技术来说,磷酸化深度并精确的鉴定主要有两大挑战,1)生物样品中不同的磷酸化肽段丰度会呈现出几个数量级的差异,这需要更高的质谱扫描速度和灵敏度来鉴定到低丰度的磷酸化肽段;2)同一个肽段发生磷酸化位点的不同,会造成同分异构的磷酸化肽段,并且这些同分异构的磷酸化肽段大部分会在色谱上共洗脱,而传统蛋白组学质谱平台不能对这些共洗脱的同分异构肽段进行分离。
现在得益于质谱技术的进步,采用布鲁克推出的4D蛋白组学平台timsTOF Pro,这两大问题都得到极大的改善。timsTOF Pro采集用双TIMS技术(捕集离子淌度技术)和PASEF技术(平行累积连续碎裂技术),在提供额外一个维度(淌度)分离的同时,带来了扫描速度和灵敏度的大幅提升。已经有大量的数据显示出了timsTOF Pro的极佳的灵敏度和蛋白覆盖深度,最近的数据则在磷酸化肽段分析上显示出了timsTOF Pro的强大(图2)。timsTOF Pro在1.1秒的扫描循环内,可以采集到超过100张ms/ms谱图(图2A),在这样高速采集下,50ug启始材料做IMAC富集的样品,90分钟梯度单针进样可以鉴定到17457个unique磷酸化修饰肽段,考察不同的色谱梯度对磷酸化修饰肽段覆盖的深度的影响,结果显示更短的色谱梯度(15min,30min, 60min)也能得到非常好的结果,15min色谱梯度单针进样即可鉴定到7446个unique磷酸化修饰肽段。

图2. A. timsTOF Pro单个扫描循环;B. 单针进样鉴定磷酸化修饰肽段数目

对于磷酸化肽段的同分异构问题,通过图3可以进行很好的解释,图3中的两个同分异构体的磷酸化肽段,分子序列完全一样,只是发生磷酸化的位置不同。这些同分异构的磷酸化肽段在一级谱图上的质量完全相同,而在二级谱图上也高度类似。面对这样微小的差别,传统的质谱鉴定和搜库软件通常难以做明确的区分,这就会导致出现错误定位(false localization)的问题。因此在处理PTM质谱数据时,需要对修饰位点进行FLR的控制。目前针对FLR的控制仍是一个挑战,主要是通过多种评估软件或算法来进行打分,但这些都是统计估算层面上的方法,并没有在质谱鉴定水平上解决修饰位点准确定位的问题。

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那么这种同分异构的现象是否普遍呢?最新的一项实验测试显示,对100ug HeLa细胞裂解液进行IMAC磷酸化修饰富集后,90min的单针检测共鉴定到18500个unique 磷酸化修饰肽段,其中6315个磷酸化肽段被鉴定为同分异构,比例达到26%(图4A)。进一步,30码期期中者对这些同分异构的磷酸化修饰肽段在不同保留时间的分布比例进行分析,结果表明50%的同分异构体在15s的保留时间窗口被洗脱出来(图4B)。以上的实验结果表明,磷酸化修饰同分异构比例很高并且不能通过保留时间进行很好的区分,这也表明传统方法难以准确识别磷酸化位点。

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令人激动的是,新一代的4D蛋白质组学除了在蛋白鉴定上有着卓越的性能,新增的离子淌度分离还能解决同分异构的问题,使得PTMs的鉴定更加可靠。图2中两个磷酸化肽段的同分异构体,尽管洗脱时间和质荷比完全一样,但是由于发生磷酸化的位置不同,所以在结构上会有差别,而4D蛋白质组学的离子淌度分离会根据碰撞截面(Collision Cross Section)大小的不同对同分异构进行区分并获得可靠的磷酸化肽段的鉴定。


在图5最新的测试数据中我们可以看到,5号和6号是两个共洗脱的同分异构磷酸化肽段,质荷比相同,色谱又不能分离,但是通过离子淌度可以很好的分离鉴定。同时,6号和7号肽段虽然质荷比一致,离子淌度值(1/k0)也比较接近,但可以通过保留时间进行区分。表中的7个磷酸化肽段,如果只依赖于质荷比和保留时间,只有能对其中2个进行精确定量,但如果再结合离子淌度信息,可对其中的5个进行精确定量分析。

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综上,4D蛋白质组学除了在蛋白质组分析方面展现出的极佳的灵敏度和覆盖深度,还能够带来更精确的磷酸化修饰的鉴定和定量分析,大幅度提高翻译后修饰位点定位和定量的可靠性,展现了4D蛋白质组学强大的功能和广泛的应用前景。

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参考文献:

1. Heiner Koch, et al., The PASEFmethod on a TIMS-QTOF mass spectrometer for High Sensitivity Phosphoproteomics.ASMS 2018, TP 555

2. Christopher M. Adams, et al., Identification and Quantitation of Phosphopeptide PositionalIsomers using Trapped Ion Mobility Spectrometry and PASEF. ASMS 2019, WP 662

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